Claudia Martínez Suárez¹, Carlos Almanza Rodríguez¹, Eduar Elías Bejarano Martínez^1-2

¹ Grupo de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Sucre. A.A. 406, Sincelejo (Colombia).

² Programa de Doctorado en Medicina Tropical, SUE-Caribe (Colombia).

Correspondencia: Eduar E. Bejarano, Grupo de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Sucre, Cra. 14 n° 16B-32, Sincelejo (Sucre), Colombia. eduarelias@yahoo.com

Resumen

Objetivo: Estimar el tiempo promedio de desarrollo de Lutzomyia evansi. Materiales y métodos: Se inició una colonia de Lutzomyia evansi con individuos recolectados en la zona urbana de la ciudad de Sincelejo (Colombia). La colonia fue mantenida en el laboratorio durante tres generaciones filiales bajo condiciones experimentales promedio de 26°C de temperatura y 94% de humedad relativa.

Resultados: La duración del desarrollo de Lutzomyia evansi fue de 36 a 45 días. El tiempo requerido para el desarrollo de los huevos fue en promedio de 6,75 días (rango de 6 a 8 días). La duración en promedio de los diferentes estadios larvales fue 5,75 días en larvas de primer estadio (rango de 5 a 8 días), 5,75 días en larvas de segundo estadio (rango de 4 a 7 días), 5 días en larvas de tercer estadio (rango de 4 a 7 días) y 7 días en larvas de cuarto estadio (rango e 6 a 8 días). En la fase de pupa, la duración en promedio fue de 9,75 días (rango de 7 a 17 días).

Conclusiones: El tiempo promedio requerido para el desarrollo de Lutzomyia evansi, comprendido desde la alimentación sanguínea de la hembra madre hasta la emergencia del adulto, es de 40 días.

Palabras clave: Flebotomíneo, Lutzomyia evansi, biología, leishmaniasis, Colombia.

Abstract

Objective: To estimate the mean development time for Lutzomyia evansi.

Materials and methods: A laboratory colony of Lutzomyia evansi was started from sand flies collected in the urban area of the City of Sincelejo, Colombia. The colony was maintained during three filial generations under experimental conditions of 26°C of mean temperature, and 94% of average relative humidity.

Results: The duration of the development of Lutzomyia evansi was from 36 to 45 days. The development time for eggs was, on average, 6, 75 days (interval from 6 to 8 days). The mean duration of the different larval instars was 5,75 days in first instar (interval from 5 to 8 days), 5,75 days in second instar (interval from 4 to 7 days), 5 days in third instar (interval from 4 to 7 days) and 7 days in fourth instar (interval from 6 to 8 days). In the stage of pupa the development time was, on average, 9, 75 days (interval from 7 to 17 days).

Conclusions: The mean development time for Lutzomyia evansi, from the female's blood meal to adult emergence, is 40 days.

Keywords: Sand fly, Lutzomyia evansi, biology, leishmaniasis, Colombia.

Introducción

La leishmaniasis es una enfermedad endémica en la Costa Caribe colombiana, donde es causada por al menos cuatro especies de Leishmania: Le. infantum, Le. braziliensis, Le. panamensis y Le. guyanensis (1). Estos parásitos son transmitidos al humano por la picadura de insectos flebotomíneos; en la Costa Caribe se destaca por su importancia Lutzomyia evansi, que actúa como vector del agente etiológico de la leishmaniasis visceral (2), que corresponde a la forma más agresiva de la enfermedad.

Los flebotomíneos son insectos holometábolos que desarrollan su ciclo de vida en ecosistemas terrestres, comúnmente referidos en la literatura como ambientes ricos en materia orgánica en descomposición (3,4). Sin embargo, en la práctica se desconocen las condiciones particulares de los microhábitats ocupados por este grupo de insectos, lo cual no solo dificulta su colonización en laboratorio, sino que también restringe el conocimiento a cerca de aspectos fundamentales de la bionomía y biología de estos dípteros, información de interés para el control vectorial.

La colonización de flebotomíneos bajo condiciones experimentales es una actividad relativamente compleja por la extrema sensibilidad de estos insectos a las condiciones del entorno (5). No obstante, el establecimiento de colonias en laboratorio es motivado, entre otros, por la necesidad de efectuar ensayos de infección experimental con microorganismos patógenos, desarrollar estudios genéticos, establecer cultivos celulares, llevar a cabo pruebas de susceptibilidad a insecticidas, caracterizar los estados inmaduros o estimar la duración del ciclo de vida (6-15).

De las más de 150 especies de Lutzomyia encontradas a la fecha en el territorio colombiano (16,17), solo once han sido colonizadas en el laboratorio: Lu. longipalpis, Lu. walkeri, Lu. evansi, Lu. shannoni, Lu. serrana Lu. ovallesi, Lu. spinicrassa, Lu. longiflocosa, Lu. quasitownsendi, Lu. youngi y Lu. torvida (5,7,8,10,12,14,18-21), generalmente a partir de ejemplares recolectados en áreas rurales donde la leishmaniasis es endémica.

El objetivo de esta investigación fue estimar el tiempo de desarrollo promedio de Lu. evansi, con base en una colonia de laboratorio integrada por flebotomíneos provenientes de una zona urbana.

Materiales y métodos

Los especímenes de Lu. evansi fueron recolectados mediante aspirado manual en una trampa Shannon, en el sector Ciudadela Universitaria del área urbana de Sincelejo (1.520.019 N, 854.150 E), ciudad donde la especie constituye más del 70% de la abundancia de flebotomíneos (22). Los ejemplares recolectados fueron depositados en una jaula de muselina de 25 cm x 25 cm, contenida, a su vez, en una caja de poliuretano expandido. Para mantener las condiciones de humedad relativa y temperatura del sitio de colecta durante el transporte de los fleboto-míneos al Laboratorio de Biomédicas de la Universidad de Sucre, se colocaron toallas de papel húmedas en la base de la caja.

Las hembras recolectadas fueron alimentadas con sangre de Mus musculus, el cual fue sedado con maleato de acepromazina a una dosis de 0.5 mg/kg; para la ingesta sanguínea se expuso el área dorsal o ventral del roedor. La metodología que se describe a continuación se deriva de trabajos previos de colonización de Lutzomyia spp. (5, 8, 14, 18). Por pareja, los flebotomíneos fueron depositados en una cámara de cría compuesta por un recipiente de plástico de 5,5 cm de alto y 6,6 cm de diámetro, con una base humedecida de yeso dental, que se usó como sustrato para la oviposición de las hembras y la crianza de las larvas. Para disminuir el riesgo de contaminación con agentes externos, los recipientes fueron cubiertos con tapas de plástico.

Las cámaras de cría se mantuvieron en condiciones de oscuridad, a 26°C de temperatura y 94% de humedad relativa promedio, dentro de una caja de poliuretano expandido que contenía toallas de papel húmedas, y solo estuvieron expuestas a la luz durante la revisión diaria. Después de la oviposición se procedió al conteo del número de huevos y a la confirmación taxonómica de especie en los adultos, los cuales fueron identificados a partir de los caracteres morfológicos indicados en las claves de Young y Duncan (23) y Galati (24). En las hembras muertas se examinó, además, el número de huevos presentes en el abdomen, a fin de establecer el porcentaje de retención.

Después de la eclosión de los huevos se realizó el conteo de las larvas criadas en masa, a las cuales se les proporcionó una dieta compuesta por alimento para perros y alimento para conejos, en proporción 1:1 (8,25). Esta mezcla fue pulverizada, envuelta en papel Manila y esterilizada en autoclave a 20 libras de presión por 20 minutos. En cada cámara de cría se depositó diariamente una alícuota de alimento esterilizado; la ración diaria se incrementó de modo progresivo conforme a la maduración de las larvas. Para determinar la transición entre los estadios larvales se registró el cambio en la coloración corporal y en el número de setas caudales, así como la presencia de la exuvia producto de la muda en la cámara de cría, lo que en conjunto permitió estimar la duración de cada fase larval.

Durante el estado de pupa se suspendió el suministro de alimento; los adultos que emergieron fueron llevados a jaulas de muselina y mantenidos allí durante tres días, después de lo cual se les proporcionó una solución azucarada saturada y sangre de ratón. Los flebotomíneos permanecieron enjaulados durante dos días más antes de ser dispuestos en parejas dentro de las cámaras de cría, con el propósito de dar inicio a una nueva generación.

Al final de cada generación se introdujeron machos silvestres de Lu. evansi, con el propósito de mantener la variabilidad genética y asegurar la continuidad de la colonización en el laboratorio hasta la tercera generación, tiempo dispuesto para estimar la duración del ciclo biológico. Para el análisis del ciclo de vida de cada una de las generaciones se utilizó el programa de cálculo numérico orientado a matrices MATrix LABoratory (MATLAB). Se determinó la duración de las fases inmaduras, el rendimiento de la colonia, el número de hembras y machos que emergieron y la razón entre los sexos.

Resultados

El tiempo promedio requerido para el desarrollo de Lu. evansi, comprendido desde la alimentación sanguínea de la hembra madre hasta la emergencia de los adultos de la siguiente generación, fue de 40 días, con un rango que varió entre 36 y 45 días. La duración en promedio de las fases de huevo, primer, segundo, tercer y cuarto estadio larval, y pupa se presentan en la tabla 1, con sus respectivos rangos. La mayor mortalidad de individuos de Lu. evansi se presentó entre el primer instar larval y la mitad del segundo instar, particularmente cuando las larvas alcanzaron los 10 a 12 días de vida, pero disminuyó en la segunda mitad de este último instar (tabla 1).

Ver Tabla 1.

El rendimiento de la colonia, calculado con base en el número de adultos obtenidos a partir del total de huevos por generación, se muestra en la tabla 2. A lo largo de las tres generaciones de Lu. evansi se registró un bajo porcentaje de eclosión. La colonia se inició con 13 hembras silvestres que se alimentaron en el laboratorio, de las cuales cuatro efectuaron oviposición, aunque en solo la mitad de estas la postura fue completa, es decir, sin retención de huevos. Las hembras silvestres pusieron en total 111 huevos, de los cuales se obtuvieron ocho adultos al final del ciclo.

Entre las hembras de la primera generación, tres de las alimentadas ovipositaron 53 huevos, sin evidencias de retención, de los cuales 15 individuos llegaron hasta el estado adulto. En la segunda generación ovipositaron seis hembras, si bien en una se observó retención de huevos. En total se obtuvieron 206 huevos y 17 ejemplares alcanzaron la fase adulta. Durante la tercera generación, seis de las hembras alimentadas ovipositaron, aunque algunas retuvieron huevos. El producto de la puesta fueron 94 huevos, a partir de los cuales se criaron siete adultos. En todas las generaciones, el balance en la razón entre los sexos se inclinó a favor de las hembras (tabla 2).

Ver Tabla 2.

Ver Tabla 3.

Discusión

La mayoría de las colonias de flebotomí-neos mantenidas en condiciones de laboratorio en el Nuevo Mundo corresponden a la especie Lu. longipalpis, que está incriminada en América como vector de Le. infantum (26). La fácil adaptación de Lu. longipalpis a las condiciones experimentales en laboratorio ha permitido la caracterización completa de su ciclo de vida, incluida la descripción detallada de los estados inmaduros de la especie (27-30). Contrariamente, son escasos los estudios de colonización de Lu. evansi (20, 31, 32), pese a que por su distribución geográfica constituye el segundo vector en importancia de Le. infantum en América.

El tiempo promedio de 40 días que conlleva el desarrollo de Lu. evansi, estimado durante esta investigación a partir de una población urbana, concuerda con lo observado en estudios previos, en los que se establecieron colonias de la especie con ejemplares recolectados en zonas rurales. Montoya-Lerma et al. (20) registraron para Lu. evansi de Colombia una duración media del desarrollo de 41,8 días, con un rango de 35,1 a 49,6 días, calculado desde la ingesta sanguínea hasta la emergencia del primer adulto. Mirsa (31) observó que el tiempo de desarrollo de Lu. evansi de Venezuela comprende entre 31 y 51 días, con un ciclo gonadotrófico de 3,1 a 3,5 días, en tanto que Oviedo et al. (32) estimaron en 39,8 días la duración media de huevo a adulto, con un intervalo de 31,3 a 48,7 días, y un tiempo promedio del ciclo gonadotrófico de 3,53 días.

A pesar de tratarse de colonias establecidas con individuos procedentes de diferentes poblaciones naturales, la relativa homogeneidad que se observa en la duración del desarrollo de Lu. evansi indica la conservación evolutiva de factores intrínsecos a la especie que regulan la duración del ciclo biológico. Es importante notar que el ciclo de este vector es relativamente más corto que el de otras especies de flebotomíneos colonizadas en Colombia, en especial de especies del grupo Lutzomyia verrucarum Theodor, 1965, en algunas de las cuales se registran promedios de duración de 61,07 a 96,8 días (5,12), a temperaturas medias de entre 22 y 28°C.

Llama la atención el aumento en el porcentaje de retención de huevos por las hembras, el cual pasó del 0% en la primera generación filial al 41.48% en la tercera generación. Teniendo en cuenta que las condiciones de la colonia se mantuvieron relativamente estables durante las tres generaciones, es difícil identificar el factor que limitó la oviposición en las hembras de Lu. evansi, aunque se han propuesto como factores determinantes el espacio reducido de las cámaras de cría y la textura del sustrato usado para la postura de los huevos.

Con relación a las larvas, el decrecimiento en la sobrevivencia de los individuos del primer y segundo estadio confirma las observaciones de Montoya-Lerma et al. (20) al señalar que estos estadios son los más frágiles al ataque de agentes externos como hongos y ácaros, así como a las gotas de agua que se acumulan en las cámaras de cría como producto del alto porcentaje de humedad. La mortalidad en los estadios tercero y cuarto fue más baja, debido probablemente al tamaño y la robustez de estas larvas, que les permitió soportar las condiciones experimentales de laboratorio y resistir el ataque de agentes contaminantes.

Finalmente, es necesario enfatizar que el estudio del ciclo de vida de Lu. evansi es fundamental para comprender cómo responde este flebotomíneo a factores climáticos, tales como: la precipitación, temperatura, humedad relativa, entre otros, algunos de los cuales se correlacionan con la abundancia poblacional de la especie (33), lo que, a su vez, es determinante en su rol como transmisor de Leishmania spp. en el litoral Caribe colombiano.

Financiación: Grupo de Investigaciones Biomé-dicas, Universidad de Sucre.

Conflicto de interés: Ninguno.

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