ARTÍCULO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

Oscar Emilio Hernández Bustos¹, Lilibeth Hernández Bustos²

¹ Docente del Departamento de Química y Biología, Universidad del Norte. Barranquilla (Colombia). ohernandezb@uninorte.edu.co.

² Estudiante de Física, Universidad del Atlántico. Barranquilla (Colombia). mitalily@gmail.com.

Correspondencia: Oscar Emilio Hernández Bustos. Universidad del Norte, km 5, antigua vía a Puerto Colombia. Barranquilla (Colombia). ohernandezb@uninorte.edu.co, oscaremilio.hernandez@gmail.com.

Resumen

Objetivo: Determinar, a partir de simulación computacional, la respuesta de un axón no mielinado a un estímulo de corriente, para diferentes valores de G_Na y G_K tales que 0S/ cm²<G_Na<6.4Slcm² y 0S/cm²<G_K<2S/cm² y a 40°C

Metodología: Se simuló con el software NEURON la propagación de potenciales de acción a través de un modelo neuronal llamado neurox. A este se le insertaron propiedades pasivas y canales de sodio y potasio al estilo HH, cuyas tasas de apertura y cierre fueron corregidas con el coeficiente térmico k.

Resultados: Existe una región de puntos en el espacio G_Navs G_K, limitada por las rectas G_Na = 12G_K + 1.4 y G_Na = 2.9 G_K + 0.73, y, en la cual se propaga un potencial de acción a través de neurox a 40°C.

Conclusión: Las conductancias de sodio y potasio al estilo HH pueden existir en neuronas que funcionan a 40°C con múltiples posibilidades de combinaciones (G_N, G_K) que permiten superar las limitaciones impuestas por el aumento en la velocidad de apertura y cierre de los canales correspondientes. Este trabajo estableció un referente metodológico para la exploración de otros espacios de combinaciones de conductancias.

Palabras clave: Conductancias de sodio y potasio al estilo HH, temperatura, simulación, propagación, potencial de acción.

Abstract

Objetive: To determine from computational simulation, the response of an unmielynate axon to a constant current stimulus for different HH style maximum sodium (G_N) and potassium (G_K) conductance in the space G_Navs. G_Ksuch that 0S/cm²<G_Na<6.4S/cm² and 0S/cm²<G_K<2S/cm² at 40C

Methodology: The propagation of action potentials along a neuronal structure called neurox was simulated using the software NEURON. Passive properties and HH style sodium and potassium channels whose opening and closing rates were corrected with the thermic coefficient, were inserted in neurox.

Results: There is a region of dots in the space G_Navs. G_Kthat are limited by the lines and on which one unique action potential is spread along the neurox at 40°C.

Conclusion: HH style sodium and potassium conductance can exist in neurons that work at 40°C, with diverse possibilities of combinations of G_Naand G_Kthat overcome the restrictions imposed by increment of speed in the opening and closing of the corresponding channels. This work established a methodological reference for exploring other areas of combinations of conductances.

Keywords: HH style sodium and potassium conductance, temperature, simulation, propagation, action potential.

En 1952, los científicos ingleses Alan Lloyd Hodgkin y Andrew Fielding Huxley descubrieron varios de los mecanismos que subyacen en la formación y propagación de potenciales de acción (PA) a través de una neurona. Para sus experimentos utilizaron el axón gigante de calamar cuyo diámetro mide alrededor de 1mm; descubrieron dos tipos de canales de sodio y potasio voltaje-dependientes como los principales responsables de la formación del potencial de acción (1 - 5) y a los cuales nos referiremos en este artículo como "canales al estilo Hodgkin y Huxley", o simplemente, "HH". La cinética de apertura y cierre de estos canales depende de la temperatura (T) (6 - 10), la cual posibilita o no el ingreso y salida, respectivamente, de la cantidad necesaria de cationes para la formación del potencial de acción. Esto es, a mayor temperatura, mayor rapidez de apertura y cierre, y a mayor rapidez de apertura y cierre, menor es el número de iones que pueden pasar a través de ellos hacia el interior o exterior celular.

En ese mismo orden de ideas, las neuronas del sistema nervioso de humanos funcionan a 37°C (11) y las de aves a 40°C (12, 13), lo cual implica que los canales de sodio y potasio al estilo HH que podrían encontrarse en la membrana de estas neuronas deben tener una densidad que permita, en el corto tiempo que permanecen abiertos, la entrada y salida del número suficiente de iones para la formación de la espiga de PA; es decir, la densidad de canales de sodio debe posibilitar la entrada del número necesario de cationes para que se produzca la fase de aumento del PA y la densidad de canales de potasio debe permitir evacuar de la célula el número suficiente de cationes para llevarla nuevamente al potencial de reposo durante la fase de repolarización (14, 15).

De especial interés resulta para los autores de este trabajo el sistema nervioso de aves, y como parte de él, los canales iónicos al estilo HH que pudieran estar insertos en sus membranas neuronales. Estos funcionan a la temperatura interna del calamar gigante, T = 6.3°C; no obstante, sus cinéticas pueden ser adaptadas para funcionar a 40°C (temperatura interna de las aves) multiplicando las tasas de apertura (α) y cierre (β) por el coeficiente térmico (7, 9):

donde T = 40 y Q₁₀ = 3.

Este último es una medida del incremento de la velocidad de apertura y cierre de un canal iónico cuando la temperatura aumenta en 10°C respecto de la temperatura de laboratorio T₀ = 6.3°C.

Una buena alternativa para estudiar el funcionamiento de los canales iónicos es la realización de simulaciones computacionales. Para esto existen varias herramientas, entre las cuales se puede destacar al software libre neuron (16 - 19), que a diferencia de otros simuladores neuronales, como nest (20) y génesis (21), entre otros, tiene la capacidad de simular fenómenos asociados a una sola neurona con total control sobre sus características biofísicas y morfológicas individuales; esto se ve reflejado en la tendencia hacia el crecimiento del número de publicaciones (en revistas de reconocido prestigio en neurociencias) que usan esta plataforma (22) (ver figura 1).

Cabe agregar que neuron, por un lado, tiene incorporado, por defecto en su código raíz, la cinética de los canales de sodio y potasio al estilo HH y la correspondiente corrección de las tasas de apertura y cierre (Ka y kβrespectivamente) para adaptarlas a temperaturas diferentes de 6.3°C; entre estas, T = 40°C; por otro lado, facilita la manipulación de los valores máximos de estas conductancias, es decir, conductancia específica máxima de sodio (G_Na) y conductancia específica máxima de potasio (G_K).

Por lo anterior, el propósito de este trabajo es Determinar, a partir de simulación computacional con el software neuron, la respuesta de un axón no mielinado a un estímulo de corriente para diferentes valores de conductancias específicas máximas de sodio y potasio al estilo HH en el espacio G_Na vs. G_K tal que 0S/cm²<G_Na < 6.4S/ cm² y 0S/cm² < G_K < 2S/cm² y en un ambiente a 40°C. Los límites 0, 6.4 y 2 en los intervalos de valores de G_K y G_Na fueron tomados en forma arbitraria. Es importante resaltar que el anterior objetivo se enfoca solo en explorar las diferentes respuestas eléctricas de un axón para diferentes combinaciones de valores (G_K, G_Na), y no en la realización de un modelo biofísico y morfológico funcional de una neurona real.

Este trabajo fue desarrollado de manera escalonada, es decir, se dio cada uno de los pasos buscando la obtención y posterior introducción de resultados en una forma secuencial. En general, el proceso consistió en la realización de diversas simulaciones usando el software libre neuron, a saber:

una estructura neuronal formada por tres secciones: un soma, un cuello axonal y un axón con las dimensiones mostradas en la Figura 2. Este modelo se realizó con el propósito de probar los algoritmos y métodos desarrollados para explorar la diversidad de perfiles de descarga asociados a un espacio de valores G_Na vs. G_K. En adelante nos referiremos a esta estructura neuronal como neurox.

Biofísica. Se insertan en el modelo neuronal, con las mismas magnitudes para todas las secciones (soma, cuello axonal y axón en la figura 2), conductancias de sodio y potasio dependientes de voltaje al estilo HH (propiedades de conducción activas) y las propiedades de conducción pasivas: conductancia específica máxima de fuga (G_fu), resistencia interna o axial (Ri) y capacitancia específica de membrana (c_m).

Simulaciones de la propagación de un potencial de acción a través de neurox. Se aplicó al soma un estímulo de corriente de 7nA de amplitud y se registró la respuesta neuronal en un punto cercano al extremo distal del axón (ver figura 2), manteniendo constantes e iguales a las del axón gigante de calamar: la conductancia específica máxima de fuga (G_fuga=0.0003S/cm²) y la resistencia axial o interna (Ri=35.4Ωcm). Además del parámetro de discretización nseg para el soma, el cuello axonal y el axón (nseg =1, nseg „ =1 y nseg_axón=250, respectivamente), el instante de tiempo al cual se aplicó el estímulo de corriente (t_del = 5 ms) y el intervalo de tiempo para la realización del muestreo virtual (dt = 0.0065 ms). Otros parámetros, como la duración del estímulo (t_dur), T, G_Na y G_K, dependieron de cada simulación en la forma descrita a continuación:

Para t_dur = 1 ms, se realizaron dos grupos de 8 simulaciones, correspondientes a T = 5, 10,15, 20, 25, 30, 35 y 40°C respectivamente.

Para el primer grupo se mantuvieron G_Na y G_K con valores fijos a 0.12S/cm² y 0.036S/cm² respectivamente. Para el segundo grupo, estas conductancias se variaron, por ensayo y error, con el propósito de mantener aproximadamente constante para cada T (ver tabla 1) la amplitud (A) del PA, al valor obtenido a T = 5°C (44.732mV).

Para T = 40°C, se varió en tres ocasiones G_Na en búsqueda de la observación de los cambios en la amplitud de la espiga para mostrar que ésta aumenta en forma proporcional a G_Na. G_K y t_dur se mantuvieron constantes a 0.5S/cm² y 1 ms respectivamente.

Para t_dur = 0.2 ms y a T= 40°C, se exploraron las respuestas de neurox a diferentes combinaciones de conductancias específicas máximas de sodio y potasio tales que 0S/ cm² < G_Na < 6.4S/cm² y 0S/cm² < G_K < 2S/cm². Es decir, se registraron las respuestas en el extremo distal del axón para diferentes combinaciones de conductancias en el espacio G_Na vs. G_K, a intervalos AG_Na = 0.2S/cm² y AG_K = 0.1S/cm².

Los gráficos 1 y 3 fueron realizados con el software QtiPlot (23) a partir de datos arrojados con neuron; los gráficos 2 y 4, directamente a partir de neuron.

En primer lugar exploramos la respuesta de neurox a diferentes temperaturas (línea 1 en el gráfico 1) y para G_Na= 0.12S/cm² y G_K=0.036S/cm² (conductancias promedios de un axón gigante de calamar). De este modo, se encontró, en forma correspondiente a resultados experimentales previos (8), que la amplitud de la espiga, para G_Na y G_K constantes, disminuye con el aumento de T. Esto se esperaba teniendo en cuenta que, como se mencionó arriba, la velocidad de apertura y cierre de los canales de sodio aumenta en forma proporcional a T.

En ese mismo orden de ideas y para cada uno de los puntos anteriores (línea 2 del gráfico 1), se variaron, por ensayo y error, las conductancias máximas de sodio y potasio con el propósito de mantener aproximadamente constante a 44.732mV (amplitud del PA para T=5°C) la amplitud de la espiga de potencial de acción. Los valores en la parte superior del gráfico 1 demuestran que para lograrlo se requiere aumentar G_Na y G_K, de tal modo que G_Na/G_K>1; es decir, para que se forme un potencial de acción en una estructura neuronal con características similares a neurox, la conductancia máxima de sodio debe ser G_Na/G_K>1 veces mayor que la conductancia máxima de potasio. Esto solo significa que se requiere la proporción G_Na/G_K >1, pero no como condición única y suficiente, ya que, por un lado, el valor de la conductancia de potasio debe ser tal que permita, durante un potencial de acción, retornar el potencial de membrana al potencial de reposo y, por otro lado, valores superiores o menores de G_Na conllevan a la formación de potenciales de acción de mayor o menor amplitud respectivamente (ver gráfico 2).

Las anteriores observaciones orientaron este trabajo a la exploración de las diferentes respuestas de neurox a T = 40°C y para diferentes valores de G_Na y G_K al estilo HH, lo cual genera varias regiones de puntos en el espacio G_Na vs. G_K (ver gráfico 3), cada una de las cuales representa un tipo de respuesta (ver gráfico 4) al mismo estímulo de corriente (ver Materiales y métodos). A continuación se describe y se explica brevemente lo observado en cada región del gráfico 3:

Región 1: No se forma ni se propaga potencial de acción alguno (ver gráfico 4A). Hacia la izquierda, la conductancia específica máxima, y por tanto la densidad de canales de sodio, es tan baja que durante la despolarización de la membrana no ingresa a la célula el número suficiente de cationes para cambiar de manera apreciable el potencial de membrana en reposo (V_r). Hacia la derecha, la conductancia específica máxima de potasio es tan alta que la célula se encuentra hiperpolarizada al potencial de reposo (V_r<-71mV), y la conductancia de sodio no es suficiente para sacarla de este estado (despolarizar), lo cual impide la formación y, por tanto, la propagación de potenciales de acción.

En esta región se encuentran las conductancias promedio de un axón gigante de calamar (rombo negro). Esto se debe a que la cinética de los canales de sodio y potasio al estilo hh es adecuada para funcionar a 6,3°C.

Región 2: Se propaga una espiga de potencial de acción con amplitud mayor o igual a 0mV (ver gráfico 4B). La magnitud de G_Na es tal que una vez realizado el estímulo de corriente, ingresa a la célula la cantidad necesaria de cationes para dar paso a la fase de despolarización del potencial de acción y G_K de magnitud suficiente para evacuar la cantidad de carga positiva que ingresó, repolarizando la membrana y, por tanto, llevándola nuevamente al potencial de reposo. Esta es la respuesta común y esperada, dada la corta duración del estímulo de corriente, 0.2 ms (ver Materiales y métodos).

La región 2 está limitada por dos rectas (líneas 1 y 2), representadas, respectivamente, por las ecuaciones:

A partir de estas se pueden extrapolar otras combinaciones de conductancias o puntos del espacio G_Na vs. G_K para las cuales se propaga una espiga de potencial de acción a través de la estructura neuronal neurox.

Es importante resaltar también que las rectas correspondientes a las ecuaciones 2 y 3 (líneas 1 y 2 en el gráfico 3)divergen a medida que aumentan G_Na y G_K, incrementando el área de puntos (G_Na, G_K), para los que se propaga un potencial de acción, y manteniendo en forma similar los resultados del gráfico 1 (ver línea 2), la relación G_Na/G_K>1 entre conductancias específicas máximas de sodio y potasio.

Región 3: Se disparan potenciales de acción de manera espontánea y en forma periódica (ver gráfico 4C). Los valores de conductancias específicas máximas de sodio son muy altos (G_Na > 3S/cm²) y la probabilidad de encontrar canales de sodio abiertos al potencial de reposo es proporcional a G_Na. De este modo, al voltaje de reposo entra, sin necesidad de aplicar un estímulo de corriente, la suficiente cantidad de cationes para la formación de una espiga de potencial de acción y la densidad de canales de potasio es apenas suficiente (G_K < 0.4S/cm² para valores mayores de G_Na aumenta este límite) para repolarizarla, retornando el voltaje de membrana al potencial de reposo. Por lo anterior, el potencial de reposo no es estable, y continuamente y de manera espontánea se disparan PA; situación similar a la de las células cardiacas marcapasos del nodo sinusual (24, 25).

Región 4: En esta región (ver gráfico 4D), la densidad de canales de sodio es muy alta respecto a la de potasio (G_Na> 3.6S/cm² y G_K=0.1S/cm², esta última para los datos evaluados). En forma similar al caso del ítem anterior, la probabilidad de encontrar canales de sodio abiertos al potencial de reposo es muy alta, por lo cual, para V_m=V, entra a la célula la cantidad suficiente de carga positiva para la formación de una espiga de potencial de acción. La conductancia, y por tanto la densidad de canales de potasio, es tan baja que no se alcanza a evacuar de la célula la cantidad suficiente de cationes para el retorno de la membrana a V_r. En su lugar, la célula se mantiene despolarizada (V_r > -71mV), es decir, aumenta el potencial de reposo.

También se observan dos puntos (asteriscos en el gráfico 3) o combinaciones de conductancias para las cuales se disparan dos potenciales de acción espontáneos sucesivos y luego se vuelve al potencial de reposo (ver gráfico 4E). Estos son puntos límite entre las regiones 2 y 3, y por lo tanto la tendencia es similar a la observada en la región 3, excepto que en este caso la conductancia de potasio es suficiente para volver la célula a un potencial de reposo estable después de disparada la segunda espiga.

En general, los resultados observados en el gráfico 3 demuestran que los canales de sodio y potasio al estilo HH pueden existir en especies cuyos sistemas nerviosos funcionan a 40°C, con múltiples posibilidades de combinaciones de conductancias G_Na y G_K (ver región 2 del gráfico 3). Es importante resaltar esto último como un resultado novedoso, en el que se exploró el espacio de respuestas de un modelo de estructura neuronal particular (neurox) a un corto estímulo de corriente y para diferentes conductancias específicas máximas de sodio y potasio al estilo HH, lo cual constituye un valioso precedente metodológico para futuros trabajos en los que se necesite explorar no solo el espacio de conductancias G_Na vs. G_K sino también otros tipos y para las cuales se propaga un potencial de acción en un modelo neuronal que, a diferencia de este, puede ser real, como los obtenidos a partir de reconstrucciones neuronales a través de sistemas microscopia computacional similares al sistema neurolucida.

Los resultados de este trabajo ponen de relieve, por un lado, que la magnitud y proporción de conductancias de sodio y potasio al estilo HH que pudieran existir en las membranas de neuronas que funcionan a temperaturas mayores de 6.3°C deben ser tales que permitan superar las limitaciones que impone su cinética de apertura y cierre.

Por otro lado, los gráficos 1 al 4 ponen en evidencia algunos aspectos muy importantes que se deben tener en cuenta al realizar simulaciones de neuronas y circuitos neuronales que involucran canales de sodio y potasio al estilo HH, en estrecha relación con los resultados experimentales. Esto es:

En primer lugar un investigador, como resultado de simular la propagación de potenciales de acción a través de un modelo neuronal virtual, podría obtener resultados diferentes de los observados en forma experimental, debido, posiblemente, al desconocimiento de todos los tipos de canales iónicos insertos en la membranas de dichos tipos neuronales. una alternativa para superar esta situación es presuponer la existencia de algún o algunos tipos específicos de canales de sodio y potasio voltaje-dependientes que posiblemente existan en estas membranas y que permitan reproducir los registros reales.

En segundo lugar los canales de sodio y potasio al estilo HH fueron observados y descritos en 1952 en axones de calamar funcionando a 6.3°C. No obstante, esto no descarta la posibilidad de que existan en neuronas de otras especies que funcionan a mayores temperaturas (37°C, 40°C..) siempre y cuando su densidad sea lo suficientemente alta para que (ver línea 2 del gráfico 1 y región 2 del gráfico 3), en el corto tiempo que tardan abiertos, dejen entrar el número suficiente de cationes, dando paso a la formación de una espiga de potencial de acción. No obstante, escoger los valores de G_Na y G_K no es tarea fácil, dado que las posibilidades son múltiples (ver región 2 del gráfico 3).

En tercer lugar los resultados del gráfico 3 son un referente metodológico para determinar los valores máximos de conductancias específicas al estilo HH (u otros tipos) que posibiliten la propagación de potenciales de acción a cualquier temperatura. otros valores G_Na y G_K pueden ser extrapolados a partir de ecuaciones ajustadas, en forma similar a las ecuaciones 2 y 3 correspondientes a las líneas que limitan la región de conducción del gráfico 3 (región 2) para el caso estudiado en este trabajo.

otro aspecto relevante de los resultados aquí obtenidos consiste en que no se conocen trabajos previos en los que, al igual que en este, se explore el espacio de combinaciones de conductancias de sodio y potasio al estilo HH que permitan la propagación de potenciales de acción a través de una neurona. Esto podría ser ampliado en futuros proyectos, al explorar el área de regiones similares a la 2 del gráfico 3, para diferentes temperaturas y diámetros axonales. Con esto se podría encontrar el tipo de relación existente entre el tamaño (área) del espacio de puntos (G_Na, G_K) al estilo HH, u otros tipos, con la geometría axonal (diámetro y longitud) a temperatura ambiente.

CONCLUSIÓN

Por lo anterior, podemos concluir, en primer lugar, que los canales de sodio y potasio al estilo HH pueden existir en neuronas de especies animales con una temperatura interna de 40°C como las aves y con múltiples posibilidades de combinaciones de conductancias específicas máximas (G_Na, G_K) que permiten superar las limitaciones impuestas por el aumento en las velocidades de apertura y cierre. En una estructura neuronal con las características geométricas y de conducción pasivas similares a neurox, los valores de G_Na y G_K para cada punto de una región del espacio G_Na vs. G_K en el que se propaga un potencial de acción están en relación G_Na / G_K > 1; además está limitada por las rectas divergentes G_Na = 12G_K + 1.4 y G_Na = 2.9G_K + 0.73. En segundo lugar, este trabajo estableció un referente metodológico para que otros investigadores exploren el espacio de dos o más combinaciones de conductancias específicas máximas presentes en una membrana neuronal, con miras a determinar su relación con diferentes perfiles de descarga.

Conflicto de intereses: Ninguno.

Financiación: Universidad del Norte.

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